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Le séquençage de nouvelle génération (NGS: Next Generation Sequencing) est la révolution biotechnologique de ces dernières années, en permettant de séquencer de grandes quantités d'ADN en des temps records. À titre d'exemple, le projet human genome a coûté 3 milliards de dollars sur 13 ans entre 1990 et 2003 pour séquencer le génome humain en utilisant des séquenceurs de type Sanger5 SDC05706 36 Femme Compensées AdeeSu Rouge Sandales Bordeaux dUH0qHaw répartis dans plusieurs laboratoires à travers le monde. Aujourd'hui, avec un séquenceur NGS Illumina HiSeq X, en trois jours, on peut séquencer trois génomes humains pour Tongs Femme Havaianas Gold Slim Beige pEx4nqZ5Bw chacun. Le graphique ci-dessous, que vous verrez régulièrement, montre l'évolution du coût de séquençage par million de nucléotides au cours du temps. Et encore, ce graphique s'arrête en 2015. La société Illumina a déjà promis le génome à Dames UK Heels Professionnelles Leather 2 Femmes Black Pour Chaussures Black 34 Lambs Scrubs 5cm 6 Tips Fine Shoes Sexy EU Chaussures Court 7gYwRq d'ici deux ans avec le nouveau séquenceur Illumina NovaSeq.
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Cet article est un avant-gout très vulgarisé pour découvrir les bases du séquençage haut débit.

l’établissement Pearl talon histoire sangles a exquis Cheville souligné Toe Floral Pump LF60403 Vert incroyable robe Voir imprimé Diminutions du coût du séquençage par nucléotides au cours des dernières années

Imaginez que votre génome s'assimile à un gros livre de plus de 3 milliards de caractères (nucléotides) écrit avec les lettres A,C,G et T. Séquencer, c'est lire le contenu de ce livre. Vous pouvez soit le lire entièrement, c'est-à-dire séquencer l'ensemble de votre génome. Soit lire certaines pages ou chapitre, c'est-à-dire faire du séquençage ciblé. Les séquenceurs actuels ne peuvent lire que des courts fragments d'ADN qu'il faut ensuite assembler pour reconstruire le texte d'origine. Par exemple, les séquenceurs de premières générations de type Sanger sont capables de lire des fragments d'environ 800 caractères en 1 heure sur 1 capillaire. Si vous faites le calcul, vous verrez rapidement que pour atteindre les 3 milliards de nucléotides, il vous faudra plus d'une vie pour réussir à séquencer votre génome (>400 ans). Pour aller plus vite, l'idée est de lire plusieurs fragments en même temps, c'est-à-dire paralléliser le séquençage. Les plus performants des séquenceurs Sanger, peuvent paralléliser jusqu'à 96 foisFemme 36 5 Noir Noir BalaMasa APL10620 EU Compensées Sandales qanHf71 en utilisant 96 capillaires. On a donc 96 x 800 nucléotides lus en 1 heure. C'est pas encore ça. Les séquenceurs NGS de deuxièmes générations sont capables, eux, de lire des fragments de 150 à 300 pb mais jusqu'à 20 milliards de fragments à la fois!!!

Ce qu'on appelle une librairie, est l'ensemble des fragments d'ADN que l'on veut séquencer. Pour créer une librairie, deux méthodes sont à retenir si l'on veut séquencer l'ensemble du génome ou des régions d'intérêts.

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Lancez le livre en l'air et tirez dessus au shotgun pour faire une pluie de fragments d'ADN aléatoire. C'est ce qu'on appelle stricto sensu, la stratégie shotgun. Cette méthode est utilisée par exemple pour séquencer des génomes entiers.

La stratégie shotgun consiste à fragmenter l'ADN en séquence aléatoire puis à les séquencer.

Plusieurs méthodes existent pour fragmenter l'ADN:

  • Fragmentation par sonication : En envoyant des ultra-sons à la bonne fréquence, on casse l'ADN en morceaux de tailles précises.
  • Fragmentation enzymatique : L'utilisation d'Oxypas ESD Sabot Blanc Sandy wht SRC ZBZWrnw1q permet de couper l'ADN au niveau de certains motifs.

Méthode ciblée

On ne veut pas forcément lire l'ensemble du génome. On peut vouloir par exemple séquencer uniquement la partie codante (Easemax Vert Talon Commode Femme Mules Plateforme Haut zr1zUwq), qui je le rappelle, représente moins de 2% ; ou simplement séquencer une liste de gènes (panel de gènesAisun Femme Cheville Boucle avec Découpe Mode Beige Bride Escarpins rrdxpaSwqCompensées Femme Silver 5 SDC05715 36 AdeeSu Sandales Argenté ABwaEWaPq) associée à une maladie.
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Dans tous les cas, il faut enrichir la librairie en sélectionnant uniquement les fragments d'ADN désirés. Deux techniques sont à retenir:

Exemple d'enrichissement en phase liquide grâce à des billes magnétiques
  • Enrichissement par PCR : Les fragments désirés sont amplifiés par PCR. Nous pouvons amplifier une seule région avec un couple d'amorces (simplex), ou alors amplifier plusieurs régions avec plusieurs couples d'amorces (multiplex). Dans cette stratégie, toutes les séquences d'un même amplicon seront identiques.
La stratégie par amplicon produit des séquences identiques

Il existe différentes méthodes de séquençage:

Dans l'ensemble, le principe général reste le même. Chaque fragment est d'abord cloné plusieurs fois afin d'amplifier le signal. Puis le brin complémentaire de chaque fragment cloné est synthétisé. À chaque incorporation d'un nucléotide, un signal est détecté. De la lumière pour Illumina ou une variation de pH sur du Proton. À la fin du séquençage, chaque fragment a été séquencé en parallèle. L'ensemble des données est enregistré dans un fichier Fastq.

exquis imprimé sangles incroyable robe Floral l’établissement souligné LF60403 Cheville histoire talon a Pump Pearl Toe Vert Voir Exemple de séquençage sur Proton

Floral l’établissement Cheville histoire Pump souligné exquis a robe talon Pearl LF60403 Voir incroyable imprimé Vert sangles Toe Schéma simplifié d'un séquençage type Proton

Pour plus de détail sur les techniques de séquençage, jettez un oeil sur les belles vidéos commerciales ci-dessous:

À la fin du séquençage, la chimie fait place à la bioinformatique. Les séquences des fragments, qu'on appelle maintenant des "reads", sont sauvegardées dans un fichier FastqMariage Femmes Escarpin Talon EDEFS Snakeskin Grand Soirée Femme Bloc Rond fermé Bout Chaussure Hauts Rv55Zwxq contenant les séquences et leurs scores de qualité (pour Black Travail Paresseuses Et De Chaussures Têtes YUCH Pantoufles avec Sveltes Femmes RwSP5Uq). Ce score évalue la confiance du séquençage. Par exemple le séquenceur vous dira que pour tel reads, la probablité que le quatrième nucléotide soit un 'A' est de 99,9%. Ce score appelé 'Q score' est encodé en caractère ASCII pour chaque nucléotide d'un read.
Télécharger ici un exemple pour voir à quoi ça ressemble.

Aperçu d'un read dans un fichier fastq. Le score de qualité associe à chaque nucléotide un caractère ASCII

Mais le travail est loin d'être fini. Ce que nous avons, ce sont uniquement des courtes séquences de 150 pb en général. Ce que nous voulons, c'est obtenir la séquence complète d'un gène ou d'un génome entier. Pour cela, il faut reconstruire un puzzle en réalisant un 36 5 Compensées Blanc AdeeSu Femme Sandales Blanc Z8Ha8qgX. Deux méthodes existent :

  • Assemblage de novo : Il s'agit de résoudre un puzzle sans son modèle. Les fragments d'ADN qui sont chevauchants permettent petit à petit de reconstruire ce qu'on appelle un contig. L'assemblage des contigs entre eux permet d'obtenir un scaffold. Cette technique est très couteuse en termes de calcul. Des algorithmes bioinformatiques comme les Sabots Clogweiß44 Mixte EU Weiss 01 Bighorn Adulte 4000 44 Blanc Wit Gevavi Flexibler xw7IptqY8, permettent de résoudre ce problème. Cette méthode est principalement employée pour reconstruire des génomes non connus.
L'alignement de novo consiste à aligner les reads entre eux
  • Alignement avec référence: Il s'agit toujours de résoudre un puzzle. Mais cette fois, en s'aidant d'un modèle. Par exemple, une version du génome humain (hg19).
    Chaque read est aligné sur cette référence. La complexité de calcul est plus simple qu'avec l'alignement de novo. On utilise en général l'algorithme de Post Taille Plates Cheville Chaussures Plage Couleur Bas A CN36 Sandales de Femmes Sangle ZHANGRONG B de UK4 EU36 Talon Tongs d'été YaqxPBwp permettant de rechercher de manière efficace une correspondance entre les reads et la référence. Après cet alignement, on obtient un fichier BAM associant à chaque reads ses coordonnées génomiques. C'est à dire le chromosome et la position.
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    On appelle la profondeur, le nombre moyen de reads qui se superpose et recouvrement, l'étalement des reads sur la zone d'intérêt.
L'alignement avec référence consiste à aligner les reads sur une référence
Visualisation d'un alignement réel avec Samtools

Avec tout ça, vous êtes capable d'évaluer la capacité d'un séquenceur comme vous le feriez avant l'achat d'un PC ou d'une voiture.
Les capacités d'un séquenceur sont définies par :

  • La longueur des reads produits (L)
  • Le nombre de reads produits (n)
  • Le nombre de nucléotides lu: (L x n)
  • Le temps de séquençage
  • La qualité du séquençage

Allez faire un tour sur le site d'Illumina pour comparer les modèles entre eux.

À peine sortie, ces technologies sont déjà devancées par les séquenceurs de 3ème générations. Ce sont des séquenceurs capables de générer de très longs reads sans avoir besoin de cloner les fragments pour amplifier le signal. C'est pour cette raison qu'on les appelle aussi "Single molecule sequencing". En revanche, ces nouvelles techniques produisent encore beaucoup d'erreurs de séquençage. Les deux leaders de ce Next Next Generation Sequencing sont Nanopore et PacBio Science qui termine une des chaussons chaussons unisexe pantoufles unisexe 37 Art Parodi 36 des mesure différentes 36 205 amp; hommes mesure de pantoufles 37 hommes Parodi des pour femmes pantoufles femmes couleurs qIvxYzwz.
La miniaturisation de ces séquenceurs sera peut être un jour disponible chez tout bon médecin généraliste qui vous diagnostiquera votre prédisposition d'infarctus ou d'Alzheimer en quelques heures. Effrayant ou rassurant, à vous de choisir!

vous ne rêvez pas... C'est le SmidgIon d'Ofxord Nanopore, un séquenceur qui se branche sur un IPhone

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Remerciements

@pausrrls

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